2014年1月6日

多能性幹細胞

器官移植最大的問題來自於捐贈者不足以及道德爭議,若能獲得一個有效充足又安全的細胞來源,將可大幅推進再生醫學的進度與普及。

作者:陳彥榮(任教台灣大學生化科技學系)

我們從一顆受精卵細胞,經過不斷的細胞分裂與細胞分化後,最終成為一個個體。然而,在人體不斷新陳代謝的過程下,有些細胞會老化與凋亡,這時候則需要由新形成的細胞來做替換,以替補維持原本的器官與組織功能。這樣的過程,幹細胞(stem cell)則扮演著重要的功能。在發育過程中,胚胎時期各式各樣的幹細胞扮演著器官形成的重要使命;在受損的器官臟器中,成體內的幹細胞則負責修復與進行代謝。由於這些幹細胞具備分化與細胞複製的能力,也成為再生醫學領域最被期待的細胞來源。

什麼是幹細胞?
身體內的大部分組成,往往都是已經成熟分化完全的細胞,例如皮膚細胞、肝臟細胞,或是口腔細胞。這些細胞的特性,在沒有任何的外力刺激或是突變下,通常被認為細胞的命運已經決定,不會再轉變為其他細胞,這樣的細胞通稱為「體細胞」(somatic cell)。

幹細胞則是和這些已經分化完成的體細胞有顯著的差異性。幹細胞是一群具備有「分化能力」(differentiation)的細胞,可以在身體內受到各式各樣的刺激,來改變細胞命運,分化成特定的細胞。

除此之外,幹細胞也具備良好的增生能力,可以進行自我更新(self-renewal)。一般的體細胞,在分化之後,幾乎不再進行細胞分裂,停止細胞增生。然而,幹細胞負擔起發育與組織修補的功能,如果不具備自我增生能力,則便無法產生足量的細胞,來執行發育與修補的功能。

當幹細胞進行細胞分裂,將由一個細胞變為兩個細胞的當下,幹細胞會接受指令;身體需要大量細胞補充功能時,幹細胞會由一個幹細胞分化成兩個下游細胞(分化)。當幹細胞需要補充時,也會由一個幹細胞變成兩個幹細胞(自我更新)。也有許多幹細胞會進行所謂的「不對稱分裂」,分裂後的細胞,一個是原本的幹細胞,一個則是欲分化的細胞。
圖一:幹細胞具備自我更新能力,可以不斷的增生。
同時,也具備分化下游細胞的能力。

幹細胞的數量往往需要精準的恆定,例如控制毛囊裡黑色素的幹細胞,如果不斷的走向「分化」,沒有即時的自我更新複製,當用完了這樣的黑色素幹細胞後,黑髮就會慢慢變成白髮。

幹細胞的能力
幹細胞依照發育時期,常聽到的主要可分為兩大類:發育時期中的幹細胞與成體幹細胞(adult stem cells)。胚胎幹細胞(embryonic stem cells)即屬於發育時期中的幹細胞,其來自於動物或是人體發育胚胎中具有多能性分化能力之幹細胞,具備能分化成各式各樣組織器官細胞的能力。在成體中,成體幹細胞則存在於各個發育成熟的組織器官中,通常為該組織之前驅細胞。到目前為止,相關文獻上已記錄了從骨髓、腸道、皮膚、肝臟等器官之案例,這些組織均能分離出此類未分化而具有分化能力的成體幹細胞。

幹細胞具備有分化能力,但是會有所不同。在胚胎發育早期,受精卵分裂發育成為八個細胞的階段,此時每一顆細胞分開後,均可以發育形成一個完整個體。這樣的幹細胞我們稱之為「全能性幹細胞」(totipotent)。另外,像是「多能性幹細胞」(pluripotent)則是可以分化成身體內的各式各樣細胞,但是沒有辦法單一顆細胞就形成個體。目前,有一些從骨髓取出的間葉型幹細胞或是造血幹細胞則可以分化成多種形式的細胞,但其分化能力較有限,某些細胞沒有辦法進行分化,這類的細胞我們稱為「多潛能幹細胞」(multipotent)。隨著不同分化層階,越後段的幹細胞,分化的能力也越有限。
圖二:幹細胞的分化潛能。幹細胞具有不同層級能力的分化潛
能,從可以形成完整個體的全能幹細胞到下游分化能力有所侷
限的幹細胞。在正常的發育過程中,往往下游低分化能力幹細
胞無法回溯至上游多潛能幹細胞。(作者提供)

人類胚胎幹細胞
由於胚胎幹細胞相較於成體幹細胞,更能達到分化為各式各樣細胞的能力,在醫療應用上也被期待(圖三)。在1998 年,美國詹姆士. 湯姆森(James Thomson)團隊利用不孕症治療手術所剩餘的胚胎細胞,自已分裂成原始囊胚體(blastocyst)之內部細胞加以分離培養,成功的得到五個細胞株。此五個細胞株具有胚胎幹細胞表面標記外,亦可進行分化,形成滋養層細胞以及外胚層、中胚層和內胚層等三個胚層組織,成為第一個人類胚胎幹細胞株(human embryonic stem cells)。
圖三:人類胚胎幹細胞集叢。胚胎幹細
胞源自囊胚內部細胞,屬多能幹細胞。

雖然人類胚胎幹細胞技術已被發展成功,但此技術牽涉到人類胚胎之取得與利用,所引起之倫理爭議引起大眾的憂慮。雖然現今在美國進行人類幹細胞之研究,已經不受以往的禁令約束,但是在美國或是其他國家,對於人類胚胎幹細胞的研究仍顧慮到來源,在細胞的取得上往往有明確的要求和限制。因此,在醫療臨床應用或是研究上,人類胚胎幹細胞仍受到道德倫理的限制而進步遲緩;另一個主要的問題在於,現在的胚胎幹細胞株並非來自於患者本身,用於治療時,無法迴避患者本身免疫系統之攻擊與排斥。

人工多能性幹細胞
儘管人類胚胎幹細胞的分離與確立,使得人們對於幹細胞科學的應用有相當的期待;然而倫理上的爭議,卻讓胚胎幹細胞的研究無法前進。因此,如果能夠透過其他方式,獲得具有多能性幹細胞能力的細胞,勢必可以讓再生醫學的發展更進一步。

體細胞核轉移
在早期,便有許多團隊投入體細胞核轉移(somatic cell nuclear transfer, SCNT)之技術,將體細胞內之細胞核注入至捐贈者之去除核的卵子中,來形成全能性幹細胞。最先發展這項技術的英國科學家約翰.戈登(John Gurdon)也因此獲得了2012 年的諾貝爾獎。然而,SCNT 技術在高等生物中,目前仍有許多問題存在。例如利用SCNT 製作出來的複製羊桃莉,牠的壽命也較正常羊隻短,推測可能是在核轉移的過程中,對於端粒造成了傷害。

過去在靈長類的SCNT 研究上,南韓黃禹錫研究團隊一度宣稱創下突破性的成果,並率先將其成果發表於Science期刊;爾後,卻被發現數據捏造,使得這個構想的可行性備受質疑。此外,在美國奧利剛健康大學的米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)團隊,利用相同的方式,從恆河猴(rhesus macaque) 的皮膚細胞,利用體細胞核轉移的方式製造出胚胎幹細胞,雖然複製的效率還是極低,但也成功從囊胚中分離出兩株胚胎幹細胞株;此乃利用SCNT 形成之胚胎幹細胞株,首度被證實可應用於靈長類。2013 年五月,米塔利波夫團隊再度運用同樣的技術,創造出以SCNT 技術製作的人類胚胎幹細胞,並且用這樣的細胞,發育成體內的各式各樣的不同細胞。這項技術雖然可以解決免疫系統排斥的問題,但是仍涉及卵子取得之道德爭議以及形成胚胎幹細胞效率不佳的困難。同時,由於過程中創造出人類全能性幹細胞,將有可能衍生出複製人,這也是倫理上值得思考的議題。

胚胎幹細胞融合– 再程序化技術
另一個可以製作多能性幹細胞的方式為利用細胞融合的方式。可以藉由將體細胞與胚胎幹細胞進行細胞融合而達成,稱為胚胎幹細胞融合– 再程序化技術(ES cell fusion-mediated reprogramming, FMR)。雖然這樣的方式可以獲得多能性幹細胞,但這個技術依然需要使用到胚胎幹細胞,以至於在將來的應用上依然牽涉到道德問題。

人工誘導式多能幹細胞
2006 年時,日本京都大學山中伸彌(Shinya Yamanaka) 教授的團隊發現只須將四個與幹細胞特性相關的轉錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc, 以及Klf4( 簡稱OSKM,也被稱為「山中因子」Yamanakafactors),利用反轉錄病毒的方式導入小鼠皮膚纖維母細胞後,即可以促使纖維母細胞重新再程序,形成具有多能性幹細胞的分化能力。這樣的細胞, 稱為「誘導式多能性幹細胞」(iPS細胞;induced pluripotent stem cells, iPS cells)。
圖四:桃莉羊。
綿羊桃莉是第一個以體細胞核轉移技術成功複製的哺乳動物。

幹細胞的能力,往往需要回到體內進行驗證。起初小鼠皮膚纖維細胞所得到的類似多能性幹細胞之能力,在2007 年獲得證實。小鼠iPS 細胞,如同胚胎幹細胞般,可以移植回到囊胚體中,隨著小鼠胚胎進行發育,最後形成「嵌合體鼠」(chimera mice)個體,也就是小鼠部分細胞來自於外源細胞(此處指iPS 細胞)。近期,又證實能由嵌合體鼠交配生殖出一整隻完全由iPS細胞來的小鼠。這些成果顯示,小鼠iPS 細胞具備有小鼠胚胎幹細胞的功能,也就是可以分化成三胚層,也能發育成一整個個體。
圖五:製作人工多能性幹細胞的三種方式。

除在小鼠中成功製作了iPS細胞,山中團隊並進一步於2007年製作出人類iPS細胞;大約同時期,美國的詹姆士.湯姆森研究團隊也以類似的技術成功製作出了人類iPS 細胞。不過,湯姆森所使用的是Sox2、Oct3/4、Lin28 和Nanog 轉錄因子,與山中團隊不同。該技術不僅操作簡便,並開創了得以從人類的體細胞(例如皮膚細胞、血液細胞)等製作出多能幹細胞之先例——不以人類胚胎為材料,不會涉及倫理問題——讓人們對於再生醫學產生了很大的期待。iPS 細胞的發明,也讓山中伸彌教授榮獲2012年諾貝爾生醫獎。

iPS 細胞的安全製作?
到目前為止,已經可以從不同物種的細胞製作iPS 細胞,例如人類、小鼠、大鼠以及獼猴(rhesus monkeys)等。目前所發表的研究報告顯示,將各式各樣體細胞,依據不同的細胞性質,導入不同種類的再程序化因子——例如把老鼠的纖維母細胞(fibroblast)導入山中因子OSKM——即可再程序化。但是在神經幹細胞中,只需要轉錄因子Oct3/4 即可促進細胞再程序化,之所以如此,最主要仍是依據細胞內這類再程序化基因的表現量;例如神經幹細胞中富含Sox2,因此不用外加Sox2 即可誘導形成iPS 細胞。不過目前製作的效率仍偏低,因此科學家們也正在嘗試利用微小RNA 或是其他因子來製作iPS 細胞,藉以提高效率。

值得注意的是,在製作iPS 細胞的轉錄因子中, 例如c-Myc 本身就是一個致癌基因,利用這樣的致癌基因雖然可以增加iPS 細胞的形成效率,但是製作出來的iPS 細胞可能有相當大的風險。爾後山中團隊的研究也發現,可以利用另一個轉錄因子n-Myc 來取代c-Myc,如此不僅避開c-Myc 的致癌危險,也能保有c-Myc 的效率。另外,使用一些小分子,例如維生素C,或是DNA 甲基轉移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitors)、組蛋白去乙醯酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor)來輔助染色體的組裝重整,均被證實可以有效增加再程序化的效率。

如何將這幾個再程序化因子導入體細胞,也是iPS 細胞在使用時重要的考量點之一。在初期,iPS 細胞的樹立,常利用一些病毒載體,包括反轉錄病毒、腺病毒及慢病毒等載體。近來也發展出有使用非病毒質體、基因的蛋白質產物,來誘導iPS 細胞形成的技術;不同的導入方式,也影響iPS形成之效率與使用安全性。

人工多能性幹細胞之研究前瞻
從iPS 細胞到造血幹細胞
日本東京大學的中內啓光教授在美國的《分子治療》期刊發表成果,指出該團隊成功將人類的iPS 細胞轉換成「造血幹細胞」,這項技術將可望有朝一日能用於治療血液相關疾病。

這項研究中,研究人員先將所製造的人類iPS 細胞,直接移植入缺乏免疫的突變小鼠體內,由於iPS 細胞具備有多能分化潛能,故在小鼠體內形成具有三胚層的畸胎瘤。在注射一些誘導生長的因子後,畸胎瘤中便進一步產生了人類的造血幹細胞。同時,這些造血幹細胞也可以再移植至小鼠的骨髓內,並證實具備正常的造血功能。

為了驗證這樣的造血幹細胞能否長期運作、發揮功能,研究人員將此類造血幹細胞取出,移植至經放射線照射過的小鼠體內;三個月後,從小鼠骨髓中仍可見到當初移入的人類造血幹細胞,並且此時小鼠體內全部的血液細胞均由這些造血幹細胞所製造。

儘管在這個研究之前,也有不少科學團隊曾嘗試將人類iPS 細胞分化至造血幹細胞,然而,這些幹細胞多半仍無法成功移植、發揮作用。待這樣的技術成熟,預計未來將有機會提供白血病等疾病新的治療方式;例如在臨床應用上,便有可能藉由「豬」或其他物種,來生產大量的造血幹細胞,用以治療過往形同絕症般的血液疾病。如此不僅克服了倫理問題,也解決了醫療上骨髓捐贈不足的困擾。

利用iPS 細胞來重現癲癇的腦內病態
在 2013 年五月,日本福岡大學以及慶應大學學者所組成的研究團隊,利用「已經無法藥物控制」的癲癇病患的皮膚細胞,成功製作出「病患的iPS 細胞」。

癲癇是一種神經系統性的疾病,通常因為腦損傷病變後,腦細胞無法正常運作,導致過度放電所引起的腦部疾病。染上癲癇的病患,終身需要靠著藥物來控制神經細胞的運作。癲癇也會出現痙攣、暫時性失憶、四肢抽搐、口吐白沫等癥狀。在目前,全球約有1%的人具有癲癇,而在這之中約有三成的患者,無法藉藥物抑制的方式控制病情。

「小兒肌張力型癲癇症候群」是由於在體內先天SCN1A 基因產生缺失,所引起癲癇狀的症候群。福岡大學和慶應大學團隊的研究內容為,利用從幼兒期就會發病的「小兒肌張力型癲癇症候群」病患的皮膚細胞製作成iPS 細胞,再利用病患的iPS細胞分化至神經細胞,其後便得以進一步利用該神經細胞來探討這類病患的腦部的機能。

這類的神經細胞的試驗結果發現,與正常人的神經細胞相比,由「小兒肌張力型癲癇症候群」病患製作出來的神經細胞所產生的「抑制性」功能的電生理訊號表現低下——其反映出病患體內神經細胞之生理——因而導致癲癇。

利用iPS 細胞形成免疫細胞大軍治療癌症
日本熊本大學的千住覺准教授在2013年七月發表了一項利用iPS 細胞進行癌症治療新方式。這項技術是將iPS 細胞在體外製作成免疫細胞,之後利用這些「被訓練好」的免疫細胞進行癌性腹膜炎或是胰臟癌的治療。

癌性腹膜炎發生在胃的外側,罹患此症的患者往往無法藉由胃癌切除手術治療,也無法有效利用抗癌藥物;在發現罹病後,往往只剩下一年多的壽命。類似的情況也發生在胰臟癌患者身上,胰臟癌在發生初期也不容易發現,一旦發現,也往往很難有效治療。

千住教授的團隊在2011 年時,已成功將iPS 細胞在體外分化成免疫系統中的巨噬細胞。千住教授希望能夠利用免疫細胞辨識外來細菌等特性,讓免疫細胞可以經過訓練,來辨識癌細胞。

在2013 年的最新研究裡,千住教授將人類的胃癌、胰臟癌細胞放入免疫缺乏的小鼠中,任其生長形成腫瘤。實驗分成兩部分,一組是在放入的過程中,同時也放入免疫細胞(由iPS 細胞分化,並具備辨識癌細胞能力);另一組則是沒有置入免疫細胞。兩週後,在有免疫細胞的群體中,幾乎所有的癌細胞都被殺死,然而沒有免疫細胞的組別,腫瘤細胞在兩週內便遍佈小鼠腹腔。

千住教授希望將來能讓這樣的技術,搭配一般現行的療法,發展出新的癌症治療方式(圖六)。
圖六:利用iPS 細胞分化至免疫細胞,用以辨識不正常病態細胞。(作者提供)

結語
人工多能性幹細胞的發現與應用,使我們對一些疑難雜症有了新的思維。儘管目前在這些人工多能性幹細胞的使用上,仍有些許安全上的疑慮,但是在這些研究過程中,也許可以給我們一些新的啟發,進而推展出不同以往的醫療方式。同時,人工多能幹細胞的製作過程伴隨著「細胞再程序化」,這個概念也顛覆了過去人類對於細胞命運的看法,此後科學家也在許多生理與病理的形成過程中看到細胞再程序化的類似情形;這些發現,將有助於使我們理解世界上繁複的生命現象,並促成研發新式的藥物與療法。