2008年12月5日

水母綠光點亮生命彩頁—繽紛奪目的螢光蛋白

三位科學家因為發現綠色螢光蛋白,發展其應用技術,研究成果卓越,共同獲得2008年諾貝爾化學獎。

作者/吳益群(任教台大分子與細胞生物學研究所)、蔣沆祥(就讀台大分子與細胞生物學研究所)
  
今年10月,在眾人翹首引領之下,瑞典皇家科學院宣布2008 年諾貝爾化學獎由日裔美籍科學家下村脩(Osamu Shimomura)、美籍科學家馬丁.查爾菲(Martin Chalfie)和華裔美籍科學家錢永健(Roger Y. Tsien)三人共同獲得,以表揚他們研究綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的卓越成果。

窺探生物體內的世界
GFP是一種螢光蛋白,在藍光或是紫外光的照射下,呈鮮綠色螢光,因此,科學家可利用GFP 來觀察生物體甚至是細胞內的生物事件。例如, GFP可以用來觀察生物體內腫瘤的成長或是病原體的移動;GFP也可以用來偵測單一細胞內的胞器、染色體的變化,或是蛋白質的產生。換言之,當顯微鏡技術帶領人類遊覽細胞內的建築之美時, GFP可說是更忠實地呈現了內在的事件變化,讓我們更詳盡地了解生命現象的運作,或是疾病的產生機制。如此豐功偉業,讓GFP 摘下諾貝爾化學獎的桂冠確是實至名歸。然而,到底GFP 是如何達成這個神奇的任務,讓我們得以窺探生物體內的祕密活動?讓我們話說從頭。

綠色螢光蛋白的誕生
諾貝爾獎得主下村脩,從1960 年開始跟隨約翰森(Frank H. Johnson)研究水母,初衷十分單純——想要了解為什麼水母會散發漂亮的光芒。為了收集大量水母做研究,他常去海邊撈拾水母,有時甚至動員妻小一起幫忙收集。後來他專注研究一種學名為Aequorea victoria 的水母;這種水母在北美西海岸隨洋流漂移,身體呈美麗的藍色,受到刺激時,其傘緣的發光器官(photoorgan)則會發出綠色螢光(圖一A)。在收集到許多A. victoria後,下村脩將水母的傘緣割下,置於濾紙上,壓榨萃取其汁液。經過約莫一年的嘗試與努力,他成功地從這些汁液中分離出水母發光蛋白(aequorin),這種分子在與鈣離子並存時會發出強烈的藍光,也就是A. victoria呈藍色的原因。同時,他也分離出另一種讓水母產生綠色螢光的物質—— GFP,這便是GFP的第一次破「水」問世。

之後數年,下村脩進一步研究出GFP在分子立體結構上,有一個特殊的發色團(chromophore,圖一B),這個特殊的球狀結構由3個胺基酸組成,在吸收藍光或是紫外光後會被激發,而散發出明亮的綠色螢光。這個發現大大顛覆了以往對發光蛋白的印象:大多數的發光蛋白都需要額外的輔助因子才能發光,如水母發光蛋白就需要有鈣離子的存在才能發出藍光。然而GFP 只需要照射藍光或紫外光,就可以發出綠色螢光。也就是說,如果想利用GFP 的螢光觀測細胞內的變化,只要給細胞正確的激發光源,它就會給予想要的資訊,不需額外加入其他分子,也不必擔心會影響細胞的正常生理。當時下村脩並沒有意識到GFP 的應用前景,對他來說,了解水母為何會發光而滿足他純粹的好奇心,就是一種莫大的幸福。但是正因為下村脩長期的熱情與執著,我們才有機會認識深藏在海洋生物體內的寶藏—— GFP ,使得後進有機會去應用這個神奇的綠色螢光蛋白。下村脩因此被譽為「生物發光研究第一人」。

圖一︰(A)會發光的水母Aequorea victoria ;(B)螢光蛋白GFP的立體結構圖,中央即為特殊的發色團結構。

綠色螢光蛋白嶄露頭角
在下村脩發現了GFP這個神奇的螢光蛋白後,馬丁.查爾菲首先將GFP應用在活體生物的觀測上。他的研究對象是線蟲Caenorhabditis elegansC. elegans的成蟲僅有2公釐大,共有959個體細胞,但是「麻雀雖小,五臟俱全」,牠有許多在人類身上可以發現的細胞種類,有完整的組織及系統;更重要的是,線蟲與人類的基因體相似度高達40%,因此具有極高的研究價值。線蟲的另一個研究優勢就是牠是透明的——我們可以直接在顯微鏡下清楚看到線蟲體內的所有細胞。馬丁.查爾菲在1977年師承Sydney Brenner(因開啟線蟲的研究領域,於2002年與John E. SulstonRobert Horvitz 共同獲頒諾貝爾生醫獎),開始線蟲神經系統的研究。最令他著迷的問題是線蟲對外界的觸覺反應:當我們用拔下的眼睫毛去輕碰線蟲的尾巴時,牠會快速地往前爬行;但若輕碰其頭部時,則會快速後退。馬丁.查爾菲發現線蟲的觸覺主要來自6個觸感神經細胞的作用,雖然利用電子顯微鏡以及免疫螢光染色技術,已經可以清楚知道這6個神經細胞的位置與連結關係,但是這兩種顯微技術都必須犧牲線蟲,而且操作繁瑣,想要在活生生的線蟲體內直接觀察追蹤神經細胞,在當時根本就是天方夜譚。

1988年美國哥倫比亞大學舉辦的學術演講中,馬丁.查爾菲知道了GFP ,這讓他非常雀躍。由於GFP是生物體內自然產生的蛋白質,因此只要在特定細胞表現這種蛋白質,就有機會讓活細胞「發光」,如此就可以用來在活體內標記特定的細胞。當時馬丁.查爾菲就想到可以將GFP 基因連接在他想研究的基因後面,再把這樣的DNA顯微注射到線蟲體內,這樣一來, GFP 所發出來的綠色螢光就像一盞探照燈,指出蛋白質產生的時間跟位置。1992年,普瑞舍(Douglas Prasher)成功地複製出GFP基因,兩年後,馬丁.查爾菲將他的想法化為真實:他將GFP基因接在一個啟動子(promoter)後面,這個啟動子在線蟲的6個觸感神經細胞中會被啟動,並形成GFP分子,使得這6個特殊的神經細胞發出綠色光芒。

馬丁的這個實驗為GFP立下一個意義非凡的里程碑,因為這證明從水母身上分離出來的GFP基因,也可以在其他物種上正確地表現與摺疊,並發出綠色螢光。這對當時的研究來說是一大福音,因為在那時,若想要利用螢光顯色來研究特定蛋白質,研究人員必須將螢光化合物以人工的方法與蛋白質接合,再注射到細胞內,此流程需要高度專業的設備與操作技術,尤其對於複雜的多細胞生物來說,執行起來十分困難。同時,螢光化合物通常具有毒性,而且每觀測一種不同的蛋白質,就必須重新進行蛋白質純化的步驟,更提高了繁瑣程度與難度。相較之下,利用啟動子來產生GFP的方式簡易許多,而且GFP對細胞也不具有毒性。因此,在馬丁.查爾菲發表這項研究的後續幾年內,利用GFP觀測細胞內蛋白質產生與變化的研究,如雨後春筍般出現。

蛋白質決定細胞的命運
為何觀測蛋白質的生成與變化是生命科學中的重要課題?因為生物體內有成千上萬不同種類的蛋白質,這些蛋白質各自執行不同的功能使細胞正常運作,也就是說,蛋白質幾乎掌控了細胞的命運。當有蛋白質發生異常時,細胞的運作就會出錯,疾病便隨之而來,這就是為何科學家急於了解各個蛋白質功能的原因。而每個蛋白質的產生,都需要經過基因上特定的啟動子啟動基因,轉錄合成mRNA,再轉譯形成蛋白質,這就是所謂的中心法則(central dogma)。

舉例來說,當你因為登山或其他原因,吸入的氧氣變少時,體內的缺氧誘導因子就會與紅血球生成激素的啟動子結合,開始製造紅血球生成激素的mRNA,然後轉譯形成紅血球生成激素,此激素可以促進紅血球的產生,最後使體內的攜氧能力提高,以適應氧氣較少的環境。如果我們在紅血球生成激素基因的DNA序列後面接上GFP基因的話(圖二),在一般氧氣充足的情況下,紅血球生成激素基因並不會表現,所以我們不會觀察到綠色螢光;但是當氧氣含量較低的時候,缺氧誘導因子與紅血球生成激素基因的啟動子結合,就會產生紅血球生成激素,此時我們將會看到這種蛋白質發出綠色的螢光。這樣的實驗策略,可以廣泛應用於探測各種細胞內的蛋白質變化,我們可以知道細胞在活體內移動的路徑,也可以知道在血管生成時,有哪些蛋白質會產生;我們甚至可以知道,當癌症產生時,有哪些蛋白質會大量地表現。

圖二:基因分子工程流程示意圖。利用基因工程技術,將GFP基因接在感興趣的基因後面,將這個人工合成基因注射到生物體內後,基因表現時轉錄轉譯而產生的蛋白質,就會發出綠色螢光。

綠色螢光蛋白大放「異彩」
然而科學家並不滿足於現況。雖然我們已經可以觀測到細胞內的蛋白質了,但如果我們想要同時觀測兩種以上的蛋白質呢?這時如果兩者都是綠色螢光的話,我們勢必無法分辨它們。錢永健為此提供了解決之道。早些時候,錢永健就已是螢光化合物的專家,他發明許多螢光化合物,用以偵測鈣離子的變化。他的研究也對GFP的發色團做了進一步的闡述,說明這個結構如何經由化學變化產生螢光,除此之外,他將238個胺基酸長度的GFP,利用基因工程的技術,在螢光蛋白中不同的胺基酸位置進行代換。藉由這個方式,他改造出螢光效果比GFP更強更穩定的EGFPenhanced GFP);同時, 他也陸續發展出不同顏色的變種GFP ,如青綠色、藍色和黃色等等(圖三)。目前科學家所使用的螢光蛋白,多半是由錢永健實驗室改造的GFP 變體,讓科學家可以藉由在不同的蛋白質上做不同顏色的標定,來研究兩種以上蛋白質的變化與彼此之間的交互關係。

圖三:將表達不同螢光的細菌塗畫在培養皿上,就成了風情萬種的日落海景。

紅光比其他顏色更容易穿透組織,因此對於研究組織或是細胞特別有用。然而當時,一直無法將GFP變種形成會散發紅色螢光的分子。後來Mikhail MatzSergei Lukyanov 這兩位俄國科學家為這個難題提出初步的解決方案。他們從散發螢光的珊瑚中找到會發螢光的蛋白質,其中一種會發出紅色螢光,即DsRED。不過DsRED較大,具有4條胺基酸鏈,因此較不適合用作生物螢光標定。對此錢永健再度發揮他的專長,將DsRED改造成只要1條胺基酸鏈就可以發出紅色螢光的蛋白質,這個蛋白質較小並且較為穩定,所以非常適合作為生物螢光標定。往後錢永健又陸續發展出許多顏色綺麗的蛋白質,如mPlummCherrymStrawberry mOrange mCitrine 等。因此,拜錢永健所賜,細胞內原本單調的世界,頓時間散發出閃亮繽紛的色彩。

美國哈佛大學的研究者,將老鼠的中樞神經系統標定上4種不同的顏色——紅色、黃色、青綠色和橘色。在不同的細胞內,會有不同的蛋白質表現量,因此產生各種不同強度的螢光,藉由這些強度跟顏色各異的螢光組合,使得中樞神經系統形成千變萬化的色彩,又被稱為腦彩虹(brainbow)。藉由這樣的色彩變化,研究者就能清楚分辨原本交纏糾結而無法辨認的神經網路。

未完待續的華麗冒險
至今科學家仍在持續努力善用GFP,利用DNA基因工程的操作,許多變種GFP陸續被發展,以產生不同的顏色或者變得更穩定。GFP也可以做為一種探測器,用來偵測重金屬:將GFP基因接至會因感應到重金屬而啟動的啟動子之後,再轉殖到細菌之內,當細菌處在具有重金屬的環境中,便會產生綠色螢光。除此之外,將GFP嵌入早期的胚胎細胞內,可以產生具有螢光的動植物,如螢光老鼠和螢光豬(圖四)。台大動物科學技術學系吳信志老師的研究室,就有這兩種螢光動物。這些螢光基因轉殖動物,提供幹細胞再生醫學一個很好的辨識系統:將幹細胞轉殖入生物體後,經過誘導分化,幹細胞會形成特定的細胞,但是這樣就無法分辨出原本生物體內的細胞,與轉殖進去後分化成功的細胞,無法確知實驗是否成功。但是這些螢光動物的幹細胞,在分化前後都會表現綠色螢光,提供一個很好的標的,讓科學家去追蹤實驗結果。

圖四:將GFP 基因嵌入早期的胚胎細胞內,可以產生具有螢光的個體,如(A)螢光鼠以及(B)螢光豬。

另外,因為有了這些繽紛色彩,螢光動植物也被利用在商業方面,例如螢光寵物或是觀賞用螢光植物。但是這些基因轉殖動植物,還存在著基因工程安全與倫理的爭議:這些動植物是否願意被殖入螢光基因而發著綠光走在街頭上呢?但無論如何, GFP的發現與發展,的確讓科學家能藉由螢光標定,更了解生物體或細胞內生命的運作,也對疾病的產生跟治療有更進一步的認識。GFP 在這方面的貢獻,是毋庸置疑的。

曖曖內含光─綠光的背後
偉大的成就都是許多人長期努力所累積而成,非一人一物一朝一夕可以達到。這次諾貝爾化學獎雖然頒給三位偉大的科學家,但在背後仍須許多人的努力付出,才能促成如此的成就。其中一位代表就是之前提到複製出GFP基因的普瑞舍。普瑞舍是下村脩的同事,當他分離複製出GFP基因時,便發現到GFP的應用前景,可惜美國國家衛生研究院拒絕了他的研究申請,沒有研究經費的他只好放棄GFP的研究。當時他將GFP基因慷慨無償給予了馬丁.查爾菲與錢永健,因此才有後續的發展。馬丁.查爾菲也提到普瑞舍的偉大貢獻,並說他能獲獎其實應該感謝普瑞舍。普瑞舍後來離開學術界,當他知道GFP獲得諾貝爾獎的消息之後,也給予誠摯的祝福。儘管諾貝爾獎與普瑞舍可說是擦身而過,但相信樂觀與知足,就是生命饋贈他最好的獎賞。

在三位諾貝爾獎得主中,下村脩的歷程較不同於其他兩位:他做了將近20年的博士後研究員,多年來沒沒無聞,雖然GFP已然如此廣泛地被運用在生物、生技與醫學的領域,但很多人卻不知道GFP最初的發現者是誰,或者是根本搞錯人。但是下村脩一路走來始終如一,他對自己的研究充滿熱誠,而且從中獲得至上的樂趣。

科學的基本精神本於純粹的求知,儘管這些人的研究在當時並沒有即時散發動人的光芒,但正因為這些基礎研究,才使得科學得以成長,也因為這些人的無悔付出,才能讓科學持續發光發亮。

圖五:GFP如今廣泛應用在各個領域,它最初的發現者就是對研究充滿熱誠的下村脩。

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