2016年8月30日

幫基因裝上一個開關—後基因標的時代關鍵工具:Cre重組酶與loxP序列

鄭淵仁/中央研究院生物醫學所博士候選人,研究利用微機械手臂與神經電生理去尋找動物感應機械力的離子通道,讓我們更瞭解人們如何感覺這個世界。

由2007年諾貝爾生醫獎得主於1980年間所建立的「小鼠胚胎幹細胞基因標的(gene targeting on mouse ES cell)」技術幫助下,生命科學家能夠改變實驗小鼠染色體DNA上的基因組。使得生物醫學研究有了長足的進展!研究人員能藉由基因剔除(gene knockout)來研究模式老鼠(mouse model); 其實驗結果可以很直觀的依據改變實驗小鼠染色體DNA去影響目標基因的RNA,然後更進一步的影響表現功能的蛋白質來推論結果!藉由比較野生型小鼠(wildtype)與基因剔除鼠(knockout mice)的表現型,生物學家們可以證明特定分子在生理現象上的角色!

可惜的是並非所有分子都可以藉由此方法,來簡單的了解它所扮演的功能。有些分子在胚胎發育或是小鼠成長過程中扮演重要角色,基因剃除可能會造成幼鼠死亡;另外有些分子同時表現在身體多個器官並且調控許多功能,剔除或是轉殖的改變,往往造成巨大的變化讓研究人員很難判斷它在單一系統或是器官的功能!為了克服這個問題,研究人員們一直渴望找到可以隨心所欲操控的基因開關,能夠在特定的時間點或是單一的系統、器官、組織甚至是特定細胞中操縱基因表現與關閉,以用來研究基因與蛋白質分子的功能。而在P1噬菌體中所發現的Cre重組酶與loxP序列,就是這麼一個完美的開關。


Cre重組酶與loxP序列的完美搭配
Cre重組酶(Cre recombinase)是1984年由漢米爾頓(Daniel. L Hamilton)與亞伯斯基(Ken Abremski)在P1噬菌體中發現的位置特異性重組酶(site-specific recombinase)。重組酶的功能在於催化基因序列重新組合;而位置特異性則意指這些重組酶會辨識基因序列上的特定排列組合來重組基因片段。以Cre重組酶為例,Cre的辨識序列就是loxPloxP序列是一段特別的DNA片段;全長34個氮鹼基,由兩組各13個氮鹼基的迴文序列(palindromic sequence),中間夾著一段8個氮鹼基的核心序列(圖一)。



圖一:loxp 序列。

圖二:重組反應由兩組核心序列的方向性來控制反應結果。當2組loxP序列的核心序列在目標基因兩側以(a) 同向排列cis-loxP序列( …GCATACAT…( 目標基因) …GCATACAT…), 則Cre 重組酶會對目標基因進行剪切反應;(b)若反向排列trans-loxP序列(…TACATACG…(目標基因)…GCATACAT…),則Cre 重組酶會對目標基因進行反轉反應。(右向為loxp左向為反向的loxp

Cre重組酶會連結交互作用的基因組中2個loxP序列,並且藉由辨識這2組loxP的位置以及中間核心序列的方向關係來進行基因的剪切或是反轉。一組同向的loxP序列(cis)會使得loxP序列中間夾集的DNA片段被剪切掉,只留下5端的loxP序列(圖二a);另一方面,一組反向的loxP序列(trans), 則會使得中間夾集的DNA片段反轉(圖二b)。這樣的基因重組反應不需要其他的輔酶(co-factor)協同參與,是一個非常理想的二元化操作系統,必須要同時具有Cre重組酶與loxP序列才能夠啟動DNA重組反應!藉由剪切與反轉的組合,生命科學家可以連結前面提到的基因標定以及傳統的基因轉殖方法或是轉染的方式,來進行更精密的基因調控!更值得慶幸的是,經過許多人前仆後繼的研究,進一步修改原生Cre重組酶與loxP序列進行體外及體內試驗之後,由羅桑(Janet Rossant)與麥克馬洪(Andrew McMahon)在1999年冷泉港的「條件式基因改良工作坊(workshop of Conditional Genome Alternation)」中總結了Cre重組酶成功在基因標定實驗小鼠上成功應用的消息!.....【更詳細的內容請見科學月刊第561期】

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