2014年3月4日

從單胞藻到腦神經細胞

作者/李志昌(任職於加拿大多倫多大學牙醫學院)

單胞藻(Chlamydomonas reinhardtii), 大小約10μm (1 μm = 10-6 公尺),一種淡水中常見的單細胞藻類。兩根長長的鞭毛,讓它們可以在水中以螺旋的方式前進(圖一),遇到光刺激時,它們會改變行進的方向,其眼點具有很靈敏的感光能力,單一光子便足以引起其運動的改變。這樣的單細胞藻類與腦神經細胞之間會有什麼關係呢?
圖一:單胞藻為球狀,有兩根鞭毛,
以螺旋翻滾方式游泳,
光線刺激可改變其行進路徑。
(作者改編自Kriiger 與黑格曼論文)

單胞藻的感光與運動控制機制的研究, 源於 1990年左右德國的科學家黑格曼(Peter Hegemann)等人所進行的一系列實驗。而其最重大的研究成果是內格爾(George Nagel)等人在 2002 與 2003 年, 發表該團隊研究單胞藻所發現的兩種感光蛋白質:光敏感通道蛋白–1(Channelrhodopsin-1, ChR1)與光敏感通道蛋白–2(Channelrhodopsin-2, ChR2),以及它們的基因序列。不僅如此, 他們還將這些基因植入蛙卵細胞(oocytes of Xenopus laevis) 或人類胚胎腎細胞(HEK293)使其製造原本只在單胞藻才有的 ChR1 或 ChR2 感光蛋白質。結果在光線的刺激下,蛙卵細胞或人類胚胎腎細胞竟然可以對光線刺激起反應。光線刺激會造成ChR1與 ChR2的蛋白質結構改變形狀,將通道打開,選擇性地讓質子流(H+)通過 ChR1 通道,或是正離子流(Na+, K+, Ca2+) 通過 ChR2通道(圖二)。在這些被植入ChR1 或ChR2 基因而表現出感光蛋白質的細胞上,他們成功地記錄到光線刺激引起的電訊號變化。
圖二:光敏感通道蛋白質ChR1 與ChR2 的結構圖。
兩者皆是離子通道,在光線刺激下,通道會打開,
ChR1 可選擇性地讓質子流(H+)通過,
ChR2 則是選擇性地讓正離子通過。
(作者改編自Sineshchekov 論文)

2005年, 在史丹福大學代塞爾羅思(Karl Deisseroth)的實驗室, 博依登(Edward Boyden) 等人成功地將 ChR2基因植入體外培養的神經細胞(取自大白鼠海馬回),在顯微鏡下以電極記錄細胞內的電位變化。經光纖傳導的藍光鐳射照射下,神經細胞開始興奮產生動作電位,他們可以用鐳射光激發神經細胞的活動,精確度高達千分之一秒的等級(圖三)。
圖三:植入ChR2基因的神經細胞,
在藍光鐳射下可以刺激神經,
使膜電位產生去極化反應。
(作者改編自博依登論文)

2007年,這個史丹福大學的實驗室,成功培養出 ChR2的基因轉殖小鼠(ChR2 transgenic mice)。他們在小鼠的大腦皮質控制肢體運動的區域,埋設記錄電極與光纖,成功地在活體上記錄到鐳射刺激所激發的神經活動。這隻基因轉殖小鼠在藍光鐳射刺激下,大腦運動區開始放電,結果你會看到小鼠像參加百米賽跑一般,啟動雷射有如鳴槍開跑,只見小鼠開始繞圈狂奔,直到藍光鐳射關閉後才慢下腳步。

2009年,MIT 媒體實驗室(MIT Media Lab, Synthetic Neurobiology Group) 的韓雪(Xue Han) 等人, 以慢病毒(Lentivirus) 當作載體, 成功地將 ChR2 基因植入猴子的大腦皮層中,使猴子的大腦神經細胞可以生產感光的蛋白質 ChR2,並能對藍光鐳射產生反應(圖四)。這個在猴子腦部完成的實驗,具有重要的指標意義,病毒載體將來自異種生物的ChR2 基因,植入靈長類腦內的特定類型神經細胞後,是否會干擾原本正常神經系統的運作?是否會引起免疫反應來對抗這些原來不屬於這個系統的外來物質?這些都是關係到這個方法可否進一步應用於人體臨床上的關鍵。可喜的是這個實驗的結論,基本上證明這個方法,至少在實驗操作的幾個月觀察期中,在猴子身上是安全的。.....【更詳細的內容,請參閱第531期科學月刊】
圖四:猴子大腦皮層ChR2 之表現以及藍光鐳射刺激示意圖。
將設計好的ChR2 與綠螢光蛋白GFP 的基因片段,以慢病毒當作載體,
將基因植入猴子的大腦皮層中。在記錄的半年內,
藍光鐳射可誘發大腦皮層神經細胞產生反應。
(作者改編自韓雪論文)
--------------------------------------------------------------
延伸閱讀
1. Hegemann and Marwan, Single photons are sufficient to trigger movement responses in Chlamydomonas reinhardtii, Photochem. Photobiol, vol. 48:99-106, 1988.
2. Boyden, A history of optogenetics: the development of tools for controlling brain circuits with light, 2011.http://f1000.com/prime/reports/b/3/11/
3. Optogenetic molecular reagents enabling control of targeted neurons and biological functions with light 2013.http://syntheticneurobiology.org/protocols

沒有留言: