2013年6月6日

一氧化氮還原酶,脫氮反應的大功臣

NOR是含鐵的一氧化氮還原酵素,在脫氮反應中催化NO產生N2O。科學家經由 取得綠膿桿菌的NOR晶格結構,進而探討NOR催化反應之生化機制。

作者/王彥文、陳政良、施昱全(就讀台灣大學植物病理與微生物學系)

氧化亞氮(N2O)在大氣中的留存期為114年, 其全球暖化能力(global warming potential, GWP)約為300,代表其溫室效應潛力約為CO2的300倍,因此N2O對臭氧層的破壞及溫室效應的影響是很可觀的。而N2O最主要的排放來源,為微生物對氮化物的分解;其中之一為在亞硝酸根(NO2-)到氮(N2)脫氮過程中會產生一氧化氮(NO) 與N2O中間產物,而「一氧化氮還原酶」(nitric oxide reductase, NOR) 就是將NO催化產生N2O的酵素。由於這項反應牽連到N-N鍵之形成與N-O的斷鍵,因此在合成化學有其意義。另外NOR在人類病原菌裡,協助病原菌破解宿主的防禦機制,例如綠膿桿菌會以細胞色素NOR(cNOR)將宿主分泌的NO毒素催化成對其無害的N2O。因此對NOR酵素群的結構探討與作用的機制研究,將有助於環境、醫療、藥物等的研發。

以往, 雖然NOR酵素催化NO的還原反應已被廣泛的探討,但仍缺乏NOR的三維結構。Hino的團隊首先研究綠膿桿菌的cNOR晶體結構(2.7Å的解析度),由此探討氮循環中NOR酵素進行催化NO還原作用的生化機制。再將NORs 與同屬血紅素銅氧化酶超家族(Heme copper oxidase super family, HCO super family)之下的一支類群酵素細胞色素c 氧化酶群(cytochrome c oxidases, COXs) 比較, 發現COXs會以氧化還原的方式,在一般動物細胞(宿主)促使電子轉移,以協助生物膜上的質子幫浦運作,並形成電位梯度,讓極性物質進出細胞膜,幫助一般宿主細胞功能正常運作。但NORs酵素則在多數微生物病原菌體裡,協助抵抗宿主細胞的防禦機制,致使病原菌得以存活下來,對宿主細胞卻相對不利。同為HCO超家族底下擁有一脈相承的兩種同源酵素群,卻造成了對宿主細胞不同的兩極影響。故詳細比較NORs與COXs結構上的差異,以及深入了解NOR 酵素的反應機制,或許能窺探演化的奧秘。

綠膿桿菌
綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa),又稱銅綠假單胞菌,是一種革蘭氏陰性菌,為好氧、呈長棒形的細菌。此菌普遍存在於週遭環境的土壤及水當中,而cNOR酵素是其膜蛋白之一,用來催化硝酸鹽的脫氮作用(圖一),是氮循環中極重要的一員。但另一方面,它也是一個伺機型感染細菌,對一些免疫力不全以及患有慢性肺疾病的病人,容易受其感染,導致許多的疾病。
圖一:脫氮路徑。

cNOR酵素的催化功能
在cNOR酵素催化NO產生N2O的還原過程中(式一),細胞色素C(cytochrome c)提供電子(electron donor),經由催化,將反應物NO 中的氮從正二價還原成正一價形成N2O。
(式一)

詳細的反應過程為,兩個NO接受兩個電子後,兩個N結合成N=N雙鍵並在兩邊的O各帶一負電荷,形成N2O22-(連二次硝酸根),之後其中一邊的N-O鍵結斷裂形成N2O,斷裂的氧離子(O2-)則與兩個H+結合形成H2O。

在P. denitrificans的酵素,cNOR 催化將NO還原成N2O,其轉移電子的最快速度為每秒轉移40~70個電子。其相伴的氧化反應以每秒轉移10個電子的速度,催化O2成為H2O。相較於一種類似的真菌酵素p450- NOR,其從NO每秒轉移約1000個電子的相較之下,cNOR就顯得速度極慢,這是為了維持NO的濃度在5 μM以上,方便NO與氧化酶的鍵結。另外,在Rhodobacter sphaeroides的COX中,其電子轉移速率為每秒大約1500個電子,由此可知在演化的過程中,cNOR傾向於較慢的方向演化,而COX反之。

另外由熱力學數據及計算結果, 發現2NO+2e-+2H+ →N2O+H2O的標準反應自由能ΔG0= -307kJ/mol,它是自發反應,亦即在此酵素作用時並不需要激發的高能電子推動整個反應。

酵素演化
NOR與COX都被歸為同屬於HCO超家族的酵素群。構造上,最主要之相似處為二者之大次單元(如NorB),皆由12個螺旋結構組成。其次,二者之雙核反應中心皆位於酵素中之疏水區,然而參與反應之金屬粒子不同(NOR 之亞鐵離子vs. COX 之銅離子,圖二)。構造上明顯之相異處則是兩者之小次單元(NorC),NOR 為α-helix( 螺旋)的構造;COX 為β-sheet(摺板)之構形。此外,在演化中COX 多出His-Tyr 共價鍵,使之能利用同源骨架中原有的血基質(heme)的電子傳遞路徑,並擁有NOR 所缺乏的質子幫浦功能的D- and K- 通道〔註一〕。【更詳細的內容,請參閱第522期科學月刊】
圖二:NOR與COX構型之差異。

註一:D-通道與K-通道為一種廣泛發現於許多酵素中的質子傳遞路徑,被認為是許多細菌酶共有的可能質子傳遞路徑。

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