2013年5月1日

科學研究的誠信問題

作者/李文山(作者任職於中研院化學所)

最近麻省理工學院化學系Alice Y.Ting教授撤回2010年發表在Cell期刊上的論文。我們應該如何看待這個問題呢?

整體事件始末原由來自於麻省理工學院化學系Alice Y. Ting教授及其博士後學者Dr. Amar Thyagarajan(唯一合作者)於2010 年10 月發表在Cell期刊論文〔註一〕 關於發展一新影像技術,BLINC(Biotin Labeling of INtercellular Contacts),可以清楚的觀察到活神經細胞表面即時的交互作用,但是在Thyagarajan離開後,Ting的實驗室成員在使用相同的質體架構(plasmid constructs)及方法(protocols)下卻無法於神經細胞上有效的重現相同結果。在Ting 主動通報校方後,麻省理工學院完成了獨立調查工作,並寫了一封信給副教務長,亦為當時Cell期刊研究副總裁Dr. Claude Canizares,說明他們發現此篇文章的唯一合作者Thyagarajan偽造及修改實驗影像,並是唯一該為此事件負責的人。Ting於2013年2月14日主動向Cell編輯撤銷該論文,Thyagarajan則拒絕簽署該撤銷文件〔註二〕
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註一:Thyagarajan, A. and Ting, A.Y., Imagingactivity-dependent regulation of neurexin-neuroligi n interactions using trans-synaptic enzymatic biotinylation, Cel l, Vol. 143:456 - 69, 2010.

註二:Retraction notice to:Imaging activity-dependent regulation of neurexin-neurol igin interact ions using trans-synaptic enzymatic biotinylation. Cell,Vol. 152: 923, 2013.

Ting於撤銷文章上明白表示, 雖然Thyagarajan的方法無法應用在神經細胞上,她的實驗室成員已陸續發現利用新變更的質體架構及方法, 才讓BLINC可以偵測到神經細胞中的跨越細胞蛋白交互作用(trans-cellular neurexin-neuroligin interactions), 且也找出為何BLINC會失敗的原因。因此,Ting實驗室立即公布新一代的影像標記方法ID-PRIME(Interaction-Dependent PRobe Incorporation Mediated by Enzymes),並將結果發表於2013年PLoS ONE期刊中〔註三〕 。美國化學會的《化學與工程新聞》週刊(C&EN) 隨即於2月25日報導了這個事件〔註四〕 ,文中指出,Thyagarajan已辭去波士頓專利公司的職務,他表示從未收到Cell對於將撤銷文章的通知,他個人亦反對撤銷的行動,他強調他已與同事重複此技術4年以上,並保證此方法之實用性,可疑的是,他留在實驗室的原始資料已被他人刪除或篡改,他由衷的希望接下來美國聯邦科研誠信辦公室(ORI)的調查,可以還他一個公道。
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註三:Liu, D.S. etal., Imaging trans-cellular neurexin-neuroligin interactions by enzymatic probel igation, PLoS One, Vol. 8: e52823, 2013.

註四:Drahl, C., MIT Probe Finds Former Postdoc Falsified Images, Chemical & Engineering News, Vol. 91: 6, 2013 (News of The Week).

到底事件的癥結在哪裡?為什麼Prof. Ting 和Dr. Thyagarajan有如此截然不同的認知及主張呢?回歸到科學層面,讓我抽絲剝繭地為此事件分析分析: Neurexins(NRX)是神經突觸前膜的附著蛋白質,可以跨越突觸(synapse)間隙與突觸後的膜蛋白neuroligin(NLG) 結合, 此跨細胞的結合作用和突觸的形成、規格及穩定性相關,是目前研究神經細胞突觸反應的熱門主題之一。為了能看見這兩個蛋白質NRX 和NLG 的交互作用,有兩個質體架構BirA-NRX和APNLG首先被Ting實驗室發展出來,BirA 是具ATP依賴性之大腸桿菌生物素連接酶(E.coli biotin ligase),可以催化它的15個長鏈胺基酸受體肽(amino acid acceptor peptide, AP)受質中的離胺酸(Lysine)生物素化(biotinylation)反應。所以,生物素化的AP即可和含螢光的共軛鏈酶親和素(streptavidin)結合,如此便可觀測到活神經細胞表面交互作用的螢光影像!這樣的設計,在學術原理層次而言相當清楚,合乎邏輯,在實驗技術而言,對於研究蛋白質的學者也並不困難,那麼,問題出在何處?為了回答為何BLINC方法在神經細胞應用碰壁的窘境,在PLoS ONE的文章中,Prof. Ting的團隊重複所有的BirA-NRX及AP-NLG的質體架構,並從這二組質體出發排列組合幾種不同的架構,測試其個別表現蛋白質的效率及即時螢光影像的觀測中發現:在人體胚胎腎細胞(HEK cells)中,BLINC的技術是有效且具再現性;但在神經細胞中卻還是失敗!分析到這,對於熟悉蛋白質研究的專家而言,立即想到不同的BirA-NRX/AP-NLG質體架構、啟動子(promoter,啟動特定基因轉錄的DNA片段)以及其他因子都會影響蛋白質在不同培養細胞中的表現程度! Ting的學生也證實在Cell文章中使用的BirA-NRX 及AP-NLG都用CMV啟動子,這是造成蛋白質的表現量太差及不穩定的原因。當Ting將CMV換成CAG啟動子或增加AP的數目(3XAP)都證實可以有效的增加蛋白質的表現量及增強鏈酶親和素的訊號,其中所使用的CAG啟動子早已被其他實驗室發表證實是在神經細胞中有很好的轉殖基因表達能力。接下來,她使用上述最好的CAG-BirANRX1β及CAG-3XAP-NLG1 質體架構組合進行實驗,還是無法看到BLINC 方法在神經細胞中產生的螢光影像。她推論可能是BirA(35KDa)太大所致,為了證明她的推測,二個不同剪接點(fusion site) 的質體架構(BirA36-NRX3β,BirA272-NRX3β)被應用於BLINC 實驗。結果,BirA36-NRX3β 或BirA272-NRX3β與3XAP-NLG1 的組合都可以在HEK 細胞中顯現BLINC 的螢光影像,只有BirA272-NRX3β 與3XAP-NLG1 的組合才可在神經細胞中顯出部分的螢光影像,即便如此,Ting 不認為此部分螢光是擴散的突觸現象,而是由於蛋白質相互重疊產生的錯覺,起因於過大的BirA蛋白質嚴重阻礙NRX3β 運輸(Trafficking)到神經表面所致。之後,Ting 捨棄了BLINC 的方法而開發了ID-PRIME 之技術,此技術以大腸桿菌硫辛酸連結酶(LplA, E. coli lipoic acid ligase)取代BirA,以連結酶受體肽LAP (the Ligase Acceptor Peptide)取代AP,便成功的觀察到神經細胞中的跨細胞蛋白交互作用影像。

至此,事件的來龍去脈大致已非常清晰,Prof. Ting 及其團隊也已經明明白白地於PLoS ONE 的發表文章中交代清楚,就如同她在C&EN報導上所說的,在論文內,科學自會說明(The science in the papers kind of speaks for itself)。讀到此處,或許大家多會贊同Ting 的說法轉而相信Thyagarajan偽造影像數據是事實。我認為身為科學工作者,在無百分之百的證據支持下,妄下斷論是相當危險的,充其量也只能說是假設,而非事實。疑點一,為何Prof. Ting 一開始不讓Dr. Thyagarajan 回到麻省理工學院,在校方的監督下,公正客觀的重複實驗呢?如同上海的中科院林國強院士,處理他的博士學生造假數據,最後撤銷JACS , 2006, 128, 5624-5625 論文一事,,林院士當時立即要求該博士學生回所重複實驗。疑點二,為何該博士後之原始影像資料已被刪除?如此一來,無人可鑑定這些原始資料及影像是否真的遭到偽造修改或只是擷取真實影像中的一小部分!Ting 也沒有針對此事說明!局部的影像資料選擇性發表在期刊上,是否稱為偽造數據呢?部分學者、教授在發表文章時,都希望學生準備好論文草稿,含所有圖表、圖像等,也因此沒有仔細分析是否學生提供的影像資料是重複穩定的實驗數據、或只是偶然發生或只發生在全影像中的局部範圍,這些影像資料在發表前的再確認分析,絕對是教授(學者)的責任。疑點三,BLINC 技術應用在人體胚胎腎細胞是成功的,卻無法在神經細胞中看到效果。這代表在科學原理上,BLINC 產生影像的理論基礎是正確的;不同質體架構在不同細胞中蛋白質的表現量或運送能力會不同,即便是在相同的實驗條件下(雖說不太可能),也會因為操作者的不同而有些許出入,我相信許多研究蛋白質的學者會同意此一看法。Ting 的團隊沒有得到與Thyagarajan 相同的結果,而Thyagarajan 信誓旦旦已重複此實驗四年也是非常有可能的事。

實驗室中出現論文撤銷,學生變造數據的情形,不該一味地由校方片面宣布都是學生個人的責任,每一位指導教授(學者)都應該有勇於承擔整體事件的責任感,不時問自己在論文發表前有沒有仔細分析、鑑定學生資料影像的準確性;實驗室的氛圍是否讓學生感到偽造數據完成實驗是必須的;還是學生個人的人格問題使之不能成為一個可信賴的科學家,這些都是從事科學教育及研究工作的我們所責無旁貸之事啊!冀共勉之!

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