2013年3月1日

綜談高速化合物篩選

高速化合物篩選是一個系統,有一套標準操作程序,將許多儀器和軟體整合起來,以便快速且準確的從大量的化合物中挑出有活性的化合物,以此為基礎,提供藥物化學家後續修飾結構之用。

作者/宋政勳(任職國家衛生研究院生技與藥物研究所)

高速化合物篩選(high throughput screening)通常是藥物開發的第一步,在選定標靶(分子、細胞或組織)和建立分析方法後,藉由整合液體處理機(liquid handler)、多功能微量盤式分析儀(microplate reader)或特殊偵測儀器、機械手臂、化合物庫(compound library)和資料處理軟體等,可快速且準確的篩選出活性化合物,作為藥物化學家後續修飾結構之用,以增強此化合物之活性、增加選擇性、降低毒性及副作用、改善藥物動力學性質和提升療效。以下一一介紹高速篩選化合物的細節。

一、分析材料和方法的選擇
依照所選擇之標靶的特性,設計出合適的分析方法。若是蛋白質標靶本身具有酵素活性,可將此蛋白質之基因送入大腸桿菌(屬於原核生物)或是真核生物的細胞株內表現,再予以純化,建立成細胞外的酵素分析試驗法(enzyme-based assay)。蛋白質的表現量並非越多越好,因為可能會因蛋白質濃度太高導致群集現象而沉澱不溶。若是標靶本身不具有酵素活性,則將此蛋白質之基因送入真核生物的細胞株(例如HEK293、CHO、昆蟲細胞或酵母菌等)內表現,然後依照它在訊息傳遞上所扮演的角色來建立成細胞內分析試驗法(cell-based assay),同樣地,表現量並非越多越好,因為標靶蛋白質本身可能會干擾細胞的代謝或對細胞有毒性。若實在挑選不出能持續表現標靶蛋白質的細胞株,則可送入誘導型的基因,讓該細胞株只在進行高速化合物篩選時才表現標靶蛋白質,這就能避免這個問題。

反應的方法有呈色、螢光、冷光三種,偵測靈敏度則依此順序增加,因此實務上較常使用螢光或冷光,呈色反應較少人用。雖然放射性反應的靈敏度和專一性最高,但是通常較少考慮使用放射性反應以避免大量輻射曝露、污染和廢棄物處理等問題。進行反應的方式可選擇均相(homogeneous)或非均相 (heterogeneous),通常均相反應較受歡迎,因為只需要一個步驟,也就是將所有的成分混在一起,時間到就可以送測了,操作簡單而且篩選快速;非均相反應則需處理好幾個步驟,較為繁瑣,篩選速度較慢,可是它的優點是訊雜比(signal to noise ratio)較好。

二、分析品質的評估
在進行高速化合物篩選時,除了要速度快,還要兼顧靈敏度和準確性,才能從化合物庫鑑定出活性化合物,因此必須有一套衡量標準,以便管制分析結果的品質,我們最常用的就是 Z–因子。由於每一組實驗都有訊號和背景值,它們之間會形成訊號浮動區間(dynamic range),此外同組數個樣品的偵測值也不會一樣,形成變異(variation),Z–因子將這兩項因素包含進來整合成一個公式,用來評估分析結果的品質。若 Z<0則表示這組實驗結果無法區分活性化合物,若 0.5>Z>0則表示這組實驗結果尚可鑑定出活性化合物,最好是能達到1>Z≧0.5,Z值最高為1,這是一個分析結果完全沒有變異的理想狀態,實際上難以達成。

三、所需使用的設備和軟體
(一)液體處理機:
為求增加速度,樣品都是置於微量盤(microplate)中進行反應,微量盤有96孔、384孔、1536孔等格式,每盤的孔數(well)愈多,篩選速度愈快。通常在96孔盤,每孔的反應液為100微升;在384孔盤,每孔的反應液為20~25微升;在1536孔盤,每孔的反應液為5微升。反應液愈少,所需之費用相對地也會減少很多。但是在開始反應之前,化合物須先經過稀釋,稀釋過的化合物和反應液也需要再分注到微量盤內,這些程序雖然簡單,在樣品數量少的情況下手動操作是沒問題,但是在數量很大的情況下,每日都要處理數十盤甚至上百盤,人力無法負荷,這時就非得借助液體處理機(圖一)了。液體處理機的核心是一個分注頭,可吸取的液體體積從數十奈升至數百微升,具有8爪、96爪或384爪,可用於稀釋或分注,也可將細胞分注種於細胞培養用的微量盤(此時液體處理機需在無菌狀態下操作),若是用於細胞內分析試驗法,還可調整分注壓力,防止細胞懸浮上來,有些特殊的機種,爪與爪之間的間距可做調整,對於不同格式的微量盤間的分注或化合物製備非常方便。


(二)微量盤式分析儀或特殊偵測儀器:
分析方法的建立也需要有適當的儀器偵測訊號,一般常用多功能微量盤式分析儀,無論是呈色、螢光或冷光反應均可偵測。呈色反應雖然較不容易受到干擾,可是因為偵測靈敏度較差,所以較少人用。螢光反應使用的人很多,它的訊號強,有許多螢光劑或螢光蛋白可選用,但是很容易產生偽陽性,這是因為反應很容易受到所添加的化合物或是細胞的自體螢光而干擾,此外因為需要激發光,這也導致背景值增加,因此有人就開發出新型的螢光劑,稱之為時差性螢光 (time-resolved fluorescence),時差性螢光劑受到激發後所產生的發射光 (emission)衰退的時間遠比一般的螢光劑長,儀器可設定在激發後一段時間才接收訊號,此時所添加的化合物或是細胞的自體螢光的發射光已經衰退完,激發光也消失了,這樣就不會干擾到反應所產生的訊號。

化學冷光反應也是許多人愛用的分析方法,它的訊號雖然沒有螢光強,但是因為不需激發光,所以背景值低,靈敏度高,常被用在基因調控的研究上,螢火蟲的冷光酶(luciferase)最常被使用,水母的冷光酶則是另一種選擇,可是由於它們是酵素,要留意化合物可能對冷光酶的活性產生影響。通常測螢光用黑色微量盤,這是因為螢光訊號較強,黑色會吸光而防止鄰近孔內的樣品產生訊號干擾而降低背景值;測冷光則是用白色微量盤,這是因為冷光訊號較弱,白色可反射光,增強訊號強度。但這是通則,如果冷光訊號夠強的話,也可採用黑盤以防止干擾進而降低背景值。【更詳細的內容,請參閱第519期科學月刊】

沒有留言: