2012年12月1日

現代藥物標靶—G蛋白偶合受體之研究解析

萊夫科維茲和克比爾卡解開了「G 蛋白偶合受體」的內部運作機制,這些知識將有助於研發能準確以這些受體為標靶的更有效藥物。

作者金克寧(任職中央研究院基因體中心)

2012年的諾貝爾化學獎頒給了羅伯特.萊夫科維茲(Robert Lefkowitz)與布萊恩.克比爾卡(Brian Kobilka)兩位美國科學家,以獎勵他們對「G蛋白偶合受體」(G protein-coupled receptors, GPCRs)研究的貢獻。這兩位科學家均為心臟科醫師,憑藉著本身的專業,他們很早就認知腎上腺素是心臟血管生理調控之關鍵荷爾蒙(亦稱激素)。然而,當時人類對於如何將腎上腺素訊息傳入細胞之機制尚未確定,藥物如何作用、細胞如何反應均尚未清楚,故他們選擇以現代分子生物學之方法,試圖釐清荷爾蒙影響心臟血管之細胞訊息機理。

三十多年間斷斷續續,人們對GPCRs之認識有如穿越時光隧道,從完全不知其生化特性,至今天解析「藥物–受體–G蛋白活化」之三元複合體晶體結構。如此進展,彷彿已能目視荷爾蒙訊息自細胞外一步一步經過GPCRs傳入細胞內,從僅僅活化G蛋白(G protein)及環單磷酸腺(cyclicadenosine monophosphate, cAMP),到今日展示GPCRs 如何參與一系列訊息蛋白激之調控;使我們如同挖到一個標靶藥物研發金礦,將大大地提昇日後生命健康品質。

萊夫科維茲可謂是GPCRs 訊息傳遞之父,而克比爾卡自從30 歲踏入萊夫科維茲實驗室起便立志解析藥物–受體–G蛋白活化之三元複合體晶體結構。經由不斷地回應各個挑戰,堅忍不拔的渡過事業低潮,三十多年來艱苦工作所累積之成果,有如萬丈高樓平地起,不但使我們日後健康更有保障,其執著與熱誠,更值得當代科學研究者尊敬傚法。

GPCRs所扮演的角色
GPCRs的作用,影響我們體內每一個細胞。從鼻子、眼睛、心臟、血管,至腦中樞神經細胞,功能上從視、嗅、味覺,以及血壓、心跳至行為與心智活動, 均有GPCRs之參與。雖然,和GPCRs有關之藥物在今日市場占約百分之40~50%,可說是與人類息息相關、和生活如影隨行,然而一般人對其所知卻相當有限,就如同乙型腎上腺素受體藥物——瘦肉精,在我們社會爭論了好一陣子。

每一個細胞,內外均被由雙層磷脂質所構成的細胞膜隔離。這層細胞膜的主要功能在於維持細胞內部生化環境之恆定,而不必要或有害之物質則被隔絕於細胞外。不過,許多細胞之生化運作需受細胞外在環境所調控,而胞膜表面的「受體」,即擔當了細胞接受外界訊息之第一線角色。尤其細胞和細胞間的聯繫互動,以及感覺外部環境,乃是基本生命現象之一;故細胞之訊息由外傳到內,與細胞內生化訊息之產生,時時刻刻都在進行著。當上游發號司令,釋放訊息之細胞便分泌化學物質,將指令傳遞給收受訊息之下游細胞。位在下游細胞膜表面,能與這些化學物質結合的受體,即為細胞接受這些外來指令的第一線工作站。當受體和訊息分子結合後,即會引發特定系列之生化反應,由此改變細胞生理,達到訊息傳遞之目的。

1960~1980年代,科學家發現許多荷爾蒙、神經激素會透過胞膜表面受體調控胞膜內G蛋白的活性,而在胞內產生第二訊息,催化下游一系列細胞生化反應,這些受體即為GPCRs(圖一)。因為發現G蛋白和提出GPCRs的概念,美國的吉爾曼(Alfred Gilman)和羅德貝爾(Martin Rodbell)獲1994年諾貝爾生醫獎。

圖一:荷爾蒙透過胞膜表面受體,調控胞膜內G蛋白活性,接著開啟一系列反應,引起細胞代謝改變。

GPCRs800多種受體之統稱,它位於細胞膜上,單一多胜鏈由七個穿越胞膜親酯性多胜α螺旋鏈組成,故又稱為7TM受體(7 tansmembrane)。它們幾乎參與了每項生理功能。GPCRs為胞膜表面接受胞外訊息,將之催化為胞內生化訊息之主要受體。小自真核單細胞之互相傳遞訊息,大至高等生物心智活動之神經訊息傳遞,GPCRs 均存於前線。在哺乳類中, GPCRs遍布於體內不同細胞組織中,讓身體回應各種荷爾蒙及外在環境等各式化學訊息。不但使細胞感覺外在之環境,更使各個不同的細胞能夠互相溝通、組成細胞團隊,完成個體之特定生理功能。

分布在感覺細胞如眼、鼻、舌之GPCRs能讓我們感覺光、氣味及味道;分布於心臟血管者則負責調控血壓、心跳及血流;分布在腦神經細胞的GPCRs執行我們思想及心智之運作。GPCRs可偵測之化學、物理訊息,包括費洛蒙、荷爾蒙、胜、大型蛋白質、氣味、神經傳導物質,電磁波其他訊息分子等。這些物理化學訊息會與GPCRs緊密結合,然後活化細胞內的G蛋白,進而誘發影響知覺、行為、心跳、血壓、血糖等等基礎功能。如果這些訊息傳導途徑出現功能異常,則會導致各種生理及心理疾病,包括糖尿病、心血管病變、憂鬱症、視覺障礙、氣喘及部份特定癌症。目前市面上的藥物,約有四成是針對它而設計。

GPCRs分離純化及基因選殖
雖然人類在1960年代,發現胞膜表面普遍存在接受胞外訊息分子,調控細胞內G蛋白活性之受體,並且了解GPCRs 主宰胞外訊息傳遞至胞內之關鍵步驟,但GPCRs之分子結構、此受體如何識別各種不同之訊息分子、如何調控下游之G蛋白……等問題相繼產生。在1970年代,欲了解受體之分子結構及功能,最簡單的方法是將受體自細胞膜上純化分離。然而,若以生物化學的方法純化分離受體分子,至少有兩項技術瓶頸必須克服。

首先,必須有精準的受體分子定量檢測技術。其次,得將受體分子自原本的細胞膜中溶解出來,進一步利用合成之磷脂雙層膜取代原本之細胞膜。這兩種純化分離受體分子之技術,在那時均尚未建立。當年25歲的萊夫科維茲,是一個年輕的心臟科醫師。雖然,已知對心臟血管而言,腎上腺素是種強效荷爾蒙,而在心血管細胞表面也必定存有一種荷爾蒙接受器,故當荷爾蒙和該接受器結合後能引起心跳加快、血壓上升;但是在當時卻沒有人能夠告訴他,這個接受器之分子構造,以及它如何將荷爾蒙之結合轉化為細胞之生理反應。故萊夫科維茲於上世紀60年代末期,開始在杜克大學醫學院的實驗室中,從事對G蛋白具有調控型腎上腺素受體定量,與細胞訊息傳遞之生化研究。

首先,他發展出利用碘125同位素標示的「乙型腎上腺素配體」和受體做競爭結合的方法,精準地定量受體在胞膜表面的濃度,以及配體和受體之親合力。他運用此法,發現了許多乙型腎上腺素藥物的藥效和其對受體親合力成正比——親合力愈高藥效愈強。更進一步,他的研究團隊利用此一受體活性技術及特定之界面活性劑,在受體純化過程中追蹤受體對同位素標示配體的這結合活性,成功地自細胞膜上經過百萬倍之分離純化,得到高純度之乙型腎上腺素受體蛋白分子。

這樣的純化過程,確實非常艱辛。畢竟從數十克之細胞膜中,僅能純化出幾十亳克之受體蛋白。萊夫科維茲及他的團隊花了十年苦工,建立用於受體純化之親合性色層分析。在研究受體的純化過程中,他奠定了自動物細胞膜表面純化GPCRs之準則;同位素標示之配體及特定之界面活性劑,給予了日後從事GPCRs研究工作者既定方法。

有了高純度之受體蛋白,他們可進行受體胺基酸排列序之鑑定。根據部分純化受體之胺基酸序列,萊夫科維茲團隊設計出受體cDNAComplementary DNA,互補DNA)片段,運用此cDNA片段,他們自體基因庫中取得了腎上腺素受體之cDNA。根據此一cDNA核酸序列轉譯,得到受體胺基酸序列。

此單胜鏈,穿過細胞膜七次。穿越膜之部分,為七個親脂性序列,在胞內及胞外各有三個由極性胺基酸序列組成的區塊(圖二)。

圖二:G蛋白偶合受體之結構示意圖。

他們發現,所得到之腎上腺素受體,與人體中的另一個受體的胺基酸序列非常的相似。這個受體,便是人類視網膜上的視紫質(rhodopsin)光受體。因此,他們意識到,必定存在著看起來相似且功能模式相同的受體家族。

大約此時,年僅30歲的年輕心臟科醫師克比爾卡初加入了萊夫科維茲團隊。雖然沒有經過正式之分子生物學相關訓練,但他對於GPCRs 結構功能之解析卻有著強烈之企圖心。過去他曾會同杜克大學生化所之研究人員,在李察遜(Jean Richarson)之結構實驗室模擬GPCRs之結構功能關係。由於當時發現,腎上腺素受體之基因沒有基因內區插入子(intron),可以直接自體基因庫中取得不同GPCRscDNA,有鑒於此,克比爾卡便建立了不同種動物之體基因庫,將整個腎上腺素受體家族轉殖出來。

雖然,腎上腺素受體在體內均被腎上腺素或副腎上腺素活化,但其不同型受體,卻分別活化不同之G蛋白。甲型腎上腺素受體通常活化Gi(抑制性G蛋白),使得細胞內cAMP之量降低;而乙型腎上腺素受體則活化Gs(刺激性G 蛋白),使胞內之cAMP量增加。

除了腎上腺素外,尚有許多甲型及乙型腎上腺素受體專一性之合成藥物,可用於區分不同之腎上腺素受體。克比爾卡手頭上有各型之腎上腺素受體cDNA加上各型專一性之受體藥物,他用基因交換工程方法作成不同組合的甲型乙型雜混受體,測試比較這批雜混受體之藥物專一性及其對胞內G蛋活化之專一性。這一系列之實驗結果顯示,受體在胞膜表面外側之穿膜螺旋鏈(TM)和藥物結合有關,胞膜內側第五穿膜螺旋鏈(TM5)及第六穿膜螺旋鏈(TM6)之間的圈塊則和G 蛋白作用。

儘管當時人們對藥物–受體–G蛋白如何產生細胞內第二訊息,已有初步共識,但若要更進一步了解:藥物如何區別受體?如何和受體結合?受體和藥物結合後構形是否改變及如何改變?受體如何將結合之資訊由胞膜表面傳給胞膜內之G蛋白……等等接下來之問題,則須要觀察藥物受體及G蛋白之三元複合物結晶構造來回答。有關受體結晶方面研究,團隊原先希望能夠和耶魯大學的結晶學家保羅.席格勒(Paul Sigler)合作,但席格勒突然過世的消息,使得這兩位心臟科醫師出身的科學家,不得不親自進行受體結晶之研究。尤其是克比爾卡,他對GPCRs結構和活化有著無以取代之熱愛。

目睹細胞膜訊息傳遞
觀察結晶構造,所使用的是稱為「X–射線結晶學」(X-ray crystallography)的技術。當X–射線照射蛋白質晶體,便會產生繞射(diffraction)效應,從繞射的圖譜便能推知蛋白質分子的形態。

雖然,克比爾卡並未受過科班結晶學相關技術的訓練,但是他有能力挑出當代各個領域之頂尖高手,加以組合並一一突破前所未有之挑戰——如何大量表達並純化受體蛋白、如何修飾受體蛋白使其更穩定、如何捆綁已形成複合體之G 蛋白之次級結構及受體、如何穩定結構不安定之G蛋白分子……等等科技瓶頸。

自從克比爾卡離開萊夫科維茲的團隊,獨力從事G蛋白受體晶體結構解析,前後一共花費了15年的時間,才得到第一個腎上腺素受體之結晶。他非常專注於結晶的取得,他幾乎將自己全部的資源投資在腎上腺素受體結晶的研究上。有一陣子,他失去了大部份研究資助,導致實驗室幾乎關閉。

要形成穩定的藥物–受體– G蛋白三元複合體,用以觀察藥物訊息如何透過受體而活化G蛋白之分子機制,克比爾卡也遇到許多個瓶頸。腎上腺素受體本身胞外N端(蛋白質鏈的起始端)之極性不夠,不易形成規則之晶體;G蛋白在GTP(三磷酸鳥苷)或GDP(二磷酸鳥苷)結合時容易和受體脫離;當G 蛋白本身內部GTP 水解區塊和另一螺旋區塊形成GTP結合中心,當沒有GTP結合時,此二個區域相對位置時常互相位移,不易形成穩定之三元複合體。

為解決受體胞膜外部極性不高、不易形成結晶的問題, 克比爾卡用一段T4lysozyme 的胜肽鏈和受體N端接在一起,以增加其極性。以焦磷酸取代GTPGDP進入G 蛋白之GTP 結合中心,藉以穩固G蛋白,如此GTP水解區塊和螺旋鏈區塊便不會相對互移,使G蛋白穩固。為了使G蛋白次級結構間之結合及和受體之結合緊密,他們用奈米抗體捆綁三元複合體,使G蛋白次級結構和受體不易脫落。最後,他們用油酸單甘油脂取代常用之界面活性劑,以容納三元複合體經過修飾後所增大之疏水性區塊。這些技術上的改善,使得三元複合體之晶體更完整,易於從事X–射線繞射解析。不但使克比爾卡得到藥物如何透過受體活化胞內G 蛋白之分子圖像,更建立取得三元複合體晶體及解析之通則(圖三)。

圖三:激活藥物–乙型腎上腺素受體–異三元G蛋白體三元複合體。(T4LT4 溶解。BI-167107:激活藥物。β2AR:乙型腎上腺素受體。GαsG蛋白α亞單位。Gβ:G蛋白β亞單位。Gγ:G蛋白γ亞單位。Nb35:奈米抗體35。)


當比較在活化三元複合體中的受體結構和單純非活化之受體結構時,很明顯的,受體細胞膜內側TM5螺旋鏈鬆張了兩個螺旋圈,而TM6螺旋鏈則向外位移了14埃(angstrom)。而這些受體結構改變,使得受體和G蛋白作用更密切,降低G蛋白對GDP之結合力、增加其對GTP之親合力,因而活化G蛋白(圖四)。

圖四:活化及非活化乙型腎上腺素受體結構比較——自胞膜內向胞膜外之剖視。深色帶狀物為非活化,淺色帶狀物為活化之乙型腎上腺素受體結構。當受體受到激活藥物活化後,細胞膜內側第五穿膜螺旋鏈鬆張了兩個螺旋圈,而第六個穿膜螺旋鏈則向外位移了14埃。(TM:穿膜螺旋鏈;ICL2:受體第二胞內環狀區域。)

G蛋白及抑制蛋白雙軌訊息傳遞— GPCRs之多元結構
其實藥物和受體結合後所引起細胞內側之生化反應,尚不僅僅限於由G蛋白所主導,而產生變化的也不僅限於第二訊息。更進一步的訊息反應,由透過「抑制蛋白」(arrestin)而活化的另一系列細胞訊息傳遞(圖五)。

圖五:G蛋白偶合受體可透過G蛋白,或透過抑制蛋白傳遞不同的細胞訊息。(GRKG蛋白偶合受體磷酸激。ERK:細胞外訊息調節活化激)

萊夫科維茲團隊早於1980年代發現,當受體被藥物持續刺激後會導致受體對藥物之敏感度大大降低,因而喪失激活G蛋白之能力,這個現象稱為「去敏感作用」。受體和激活藥物結合後所誘發之結構變化,不但活化G蛋白,同時也會活化抑制蛋白。受體和抑制蛋白結合後,不但會阻礙受體繼續活化G蛋白(產生去敏感作用),同時也會透過抑制蛋白誘發新細胞訊息的產生。尤其是當抑制蛋白和受體結合成複合體時,「網格蛋白」促發此複合體自胞膜表面內吞至胞內形成「核內體」,此核內體被證實能夠活化包括細胞外訊息調節活化激(ERK),磷脂酶肌醇3激等細胞訊息酵素,這些均是由於抑制蛋白活化而產生之細胞內生化反應。

GPCRs活化時至少會誘發細胞內兩條不同訊息途徑:(一)G蛋白活化所引起的是胞內第二訊息變化;(二)活化抑制蛋白,則是引發去敏感作用、內吞現象及活化下游不同磷酸激等。這些由抑制蛋白主導之訊息,和G蛋白所主導的生化反應非常不同。接下來的有趣問題是, G蛋白和抑制蛋白的活化,是否均由同一構形或不同構形的藥物–受體複合體所誘發?「偏好藥物」的發現,使我們能夠更進一步了解當受體和不同的藥物結合時,很可能形成不同構形之藥物–受體複合體。

當研究血管收縮素受體及其活化藥物時,萊夫科維茲團隊發現,某些藥物和受體結合後會選擇性地活化由G蛋白或由抑制蛋白主導之細胞訊息。這種對下游訊息傳遞具有選擇性的藥物,稱之為偏好藥物。從一系列以偏好藥物、突變受體,以及突變抑制蛋白研究偏好訊息傳遞之結果得知,不同的受體激活藥物的確能誘發受體產生不同的構形組合。正常激活劑引發受體之構形變化,包括能夠活化G蛋白之受體構形,及稍後能夠活化抑制蛋白,使其能夠產生去敏感作用及活化下游之蛋白激。然而偏好藥物則僅能活化G蛋白,或只活化抑制蛋白。而血管收縮素偏好藥物之研究即顯示,其偏好藥物僅能活化抑制蛋白,卻不能活化G蛋白。

正常藥物經由受體而引發之抑制蛋白構形變化,與偏好藥物所引發之變化並不同。因為藥物不會直接和抑制蛋白作用,故不同藥物所促成的受體構形,將誘發抑制蛋白產生不同之結構變化。在此例子中,偏好藥物引發的受體構形不但不能活化G 蛋白,並且其引發抑制蛋白的構形也是異於正常藥物所引發的。這個現象明確地顯示:受體之構形,在決定細胞訊息傳遞中份演著非常關鍵之角色;更重要的是,受體之構形是動態的、變化多端的,而藥物之功能即在於,能夠鎖定受體於某些特定構形。

抑制蛋白和結構變化之受體結合後,不但阻隔了受體和G蛋白之作用,更引發了其所主導的另一條訊息傳遞途徑。被抑制蛋白結合的受體,經由網格蛋白而產生內吞反應,在胞內形成核內體。至少有兩種以上之生化反應可能發生:(一)受體上之磷酸經由去磷酸酵素作用而被水解離開,使得受體再度恢復敏感性;(二)在核內體之磷酸化受體及抑制蛋白,有能力活化細胞訊息調控激酵素或者其它的訊息傳遞途徑。

由於GPCRs普遍存在於各個組織,包括中樞神經細胞,對神經反應而言,活化及去活化均要快速。持續之GPCRs活化,將會造成組織喪失對神經激素或荷爾蒙之反應。由抑制蛋白主導的另一系列反應,則會降低或中止藥物對G蛋白之持續刺激。GPCRs所誘發之細胞訊息選擇性,在醫藥治療上必須要加以重視。

在此以嗎啡治療痛疼為例:當「鴉片受體」被活化時,G蛋白及抑制蛋白兩條訊息傳遞途徑均會被活化;除止痛外,同時伴隨而來的是呼吸下降、腸胃蠕動變慢、藥物去敏感及上癮等副作用。尤其呼吸抑制,是造成嗎啡過量致死之主要原因。但若以抑制蛋白基因剔除之小鼠,做嗎啡之止痛研究,發現過量之嗎啡並未使抑制蛋白基因剔除之個體產生致命的副作用,這發現說明嗎啡之可怕副作用是由抑制蛋白所主導,而G蛋白活化途徑則負責嗎啡之止痛功能。若能研發對G蛋活化具偏好性的嗎啡藥物,使其僅能活化G蛋白但不活化抑制蛋白,則可以迴避嗎啡之致命副作用,但仍保有其止痛功能。因此,藉著了解受體結構和作用的方式,將有助於研製更有效且較無副作用的藥物。

由於GPCRs對我們生理的影響無所不在,是今日新藥研發之主要標靶,許多新藥研發機構己運用當前所掌握的分子晶體資訊,從事電腦模擬藥物的篩選以及修飾。既知藥物分子結構決定受體構形之變化,及其有選擇性地對下游一系列訊息蛋白之調控,這些知識讓我們能夠研發出更細緻、作用更專一之下一代新藥物。飲水思源,兩位大師多年來所付出的種種努力,以及其成就對人類日後生命健康之貢獻,想必代價可遠超過了120萬美元的諾貝爾獎金。

圖六:萊夫科維茲畢業於紐約哥倫比亞大學醫學院,現為杜克大學教授。萊夫科維茲所主導的研究,逐漸解開了G蛋白偶合受體作用方式的秘密,美國臨床醫學會對其努力不懈、樂於與人分享成果的態度讚譽有加。

圖七:克比爾卡與他隸屬於史丹佛大學醫學院的研究室。克比爾卡的團隊在2011年拍攝到藥物透過受體活化胞內G蛋白之分子圖像,被瑞典皇家科學院譽為「分子學的傑作」。

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